PCR, là phản ứng chuỗi polymerase, đề cập đến việc bổ sung dNTP, Mg2+, các yếu tố kéo dài và các yếu tố tăng cường khuếch đại vào hệ thống dưới sự xúc tác của DNA polymerase, sử dụng DNA gốc làm mẫu và các đoạn mồi cụ thể làm điểm bắt đầu mở rộng, Thông qua các bước biến tính, ủ, mở rộng, v.v., quá trình sao chép DNA chuỗi con bổ sung vào DNA mẫu của chuỗi gốc trong ống nghiệm có thể khuếch đại nhanh chóng và đặc biệt bất kỳ DNA mục tiêu nào trong ống nghiệm.
1. PCR khởi động nóng
Thời điểm bắt đầu khuếch đại trong PCR thông thường là không đưa máy PCR vào máy PCR, sau đó chương trình bắt đầu khuếch đại.Khi cấu hình hệ thống hoàn tất, quá trình khuếch đại bắt đầu, điều này có thể gây ra hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu và PCR khởi động nóng có thể giải quyết vấn đề này.
PCR khởi động nóng là gì?Sau khi hệ thống phản ứng được chuẩn bị, chất điều chỉnh enzyme được giải phóng ở nhiệt độ cao (thường cao hơn 90°C) trong giai đoạn làm nóng ban đầu của phản ứng hoặc giai đoạn “khởi động nóng”, để DNA polymerase được kích hoạt.Thời gian và nhiệt độ kích hoạt chính xác phụ thuộc vào bản chất của DNA polymerase và chất điều biến khởi động nóng.Phương pháp này chủ yếu sử dụng các chất biến đổi như kháng thể, phối tử ái lực hoặc chất biến đổi hóa học để ức chế hoạt động của DNA polymerase.Do hoạt động của DNA polymerase bị ức chế ở nhiệt độ phòng, công nghệ khởi động nóng mang lại sự tiện lợi lớn cho việc chuẩn bị nhiều hệ thống phản ứng PCR ở nhiệt độ phòng mà không làm mất đi tính đặc hiệu của phản ứng PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (PCR phiên mã ngược) là một kỹ thuật thử nghiệm để sao chép ngược từ mRNA thành cDNA và sử dụng nó làm khuôn mẫu để khuếch đại.Quy trình thí nghiệm trước tiên là trích xuất RNA tổng số trong các mô hoặc tế bào, sử dụng Oligo (dT) làm mồi, sử dụng enzyme sao chép ngược để tổng hợp cDNA, sau đó sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại PCR để thu được gen mục tiêu hoặc phát hiện biểu hiện gen.
3. PCR định lượng huỳnh quang
PCR định lượng huỳnh quang (Real-time PCR định lượng,RT-qPCR) đề cập đến phương pháp thêm nhóm huỳnh quang vào hệ thống phản ứng PCR, sử dụng sự tích lũy tín hiệu huỳnh quang để theo dõi toàn bộ quá trình PCR trong thời gian thực và cuối cùng sử dụng đường cong chuẩn để phân tích định lượng mẫu.Các phương pháp qPCR thường được sử dụng bao gồm SYBR Green I và TaqMan.
4. PCR lồng nhau
PCR lồng nhau đề cập đến việc sử dụng hai bộ mồi PCR cho hai vòng khuếch đại PCR và sản phẩm khuếch đại của vòng thứ hai là đoạn gen mục tiêu.
Nếu sự không khớp của cặp mồi đầu tiên (mồi bên ngoài) khiến sản phẩm không đặc hiệu bị khuếch đại thì khả năng vùng không đặc hiệu đó được cặp mồi thứ hai nhận ra và tiếp tục khuếch đại là rất nhỏ, do đó, khuếch đại bằng cặp mồi thứ hai thì độ đặc hiệu của PCR đã được cải thiện.Một ưu điểm của việc thực hiện hai vòng PCR là nó giúp khuếch đại đủ sản phẩm từ số lượng DNA ban đầu hạn chế.
5. PCR chạm xuống
Touchdown PCR là phương pháp nâng cao tính đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách điều chỉnh các thông số của chu trình PCR.
Trong PCR chạm xuống, nhiệt độ ủ trong vài chu kỳ đầu tiên được đặt cao hơn một vài độ so với nhiệt độ ủ tối đa (Tm) của mồi.Nhiệt độ ủ cao hơn có thể làm giảm hiệu quả sự khuếch đại không đặc hiệu, nhưng đồng thời, nhiệt độ ủ cao hơn sẽ làm trầm trọng thêm sự phân tách mồi và trình tự đích, dẫn đến hiệu suất PCR giảm.Do đó, trong vài chu kỳ đầu tiên, nhiệt độ ủ thường được đặt ở mức giảm 1°C mỗi chu kỳ để tăng hàm lượng gen mục tiêu trong hệ thống.Khi nhiệt độ ủ được hạ xuống nhiệt độ tối ưu thì nhiệt độ ủ được duy trì cho các chu kỳ còn lại.
6. PCR trực tiếp
PCR trực tiếp đề cập đến việc khuếch đại DNA mục tiêu trực tiếp từ mẫu mà không cần phân lập và tinh chế axit nucleic.
Có hai loại PCR trực tiếp:
phương pháp trực tiếp: lấy một lượng nhỏ mẫu và thêm trực tiếp vào PCR Master Mix để nhận dạng PCR;
Phương pháp Cracking: sau khi lấy mẫu mẫu, cho vào lysate, lyse để giải phóng bộ gen, lấy một lượng nhỏ dịch nổi phía trên ly giải cho vào PCR Master Mix, thực hiện nhận dạng PCR.Cách tiếp cận này đơn giản hóa quy trình thử nghiệm, giảm thời gian thực hiện và tránh mất DNA trong các bước tinh chế.
7. PCR SOE
Ghép gen bằng phương pháp PCR mở rộng chồng chéo (SOE PCR) sử dụng các đoạn mồi có hai đầu bổ sung để làm cho sản phẩm PCR tạo thành các chuỗi chồng chéo, sao cho trong phản ứng khuếch đại tiếp theo, thông qua việc kéo dài các chuỗi chồng chéo, các nguồn kỹ thuật A khác nhau trong đó các đoạn khuếch đại được chồng chéo lên nhau và ghép lại với nhau.Công nghệ này hiện có hai hướng ứng dụng chính: xây dựng gen tổng hợp;đột biến định hướng tại vị trí gen.
8. IPCR
PCR nghịch đảo (IPCR) sử dụng các đoạn mồi bổ sung ngược để khuếch đại các đoạn DNA khác ngoài hai đoạn mồi và khuếch đại các trình tự chưa biết trên cả hai mặt của đoạn DNA đã biết.
IPCR ban đầu được thiết kế để xác định trình tự của các vùng lân cận chưa biết và chủ yếu được sử dụng để nghiên cứu trình tự khởi động gen;sắp xếp lại nhiễm sắc thể gây ung thư, chẳng hạn như phản ứng tổng hợp gen, chuyển vị và hoán vị;và tích hợp gen virus, hiện nay cũng thường được sử dụng. Đối với đột biến định hướng tại chỗ, hãy sao chép một plasmid có đột biến mong muốn.
9. dPCR
PCR kỹ thuật số (dPCR) là một kỹ thuật định lượng tuyệt đối các phân tử axit nucleic.
Hiện tại có ba phương pháp định lượng phân tử axit nucleic.Phép đo quang dựa trên độ hấp thụ của các phân tử axit nucleic;PCR định lượng huỳnh quang thời gian thực (Real Time PCR) dựa trên giá trị Ct và giá trị Ct đề cập đến số chu kỳ tương ứng với giá trị huỳnh quang có thể được phát hiện;PCR kỹ thuật số là công nghệ định lượng mới nhất dựa trên phương pháp PCR đơn phân tử để đếm định lượng axit nucleic là một phương pháp định lượng tuyệt đối.
Thời gian đăng: 13-06-2023